蔡司激光共聚焦显微镜长期助力科研学者成功，因为它们提供可靠的共聚焦成像，并不断融入创新技术。您很难找到一款显微镜，能像蔡司LSM 900一样出色地将共聚焦成像精髓与创新融为一体。各种成像模式可让您在一次实验中整合从分子到大体积的信息。例如，相较传统检测器，Airyscan能收集更多光子和空间信息，非常适合低光毒性的超分辨成像、提高实验效率，甚至是分子动力学测量。此外，配置Airyscan检测器不再让信号通过针孔到达单一检测器，而是由32个检测器单元组成，每个检测器单元都相当于一个小的针孔，在每个扫描位置都获得焦平面信息。通过将32个检测器单元组合成一个大靶面阵列检测器，Airyscan可以收集到更多荧光信号，捕捉到结构的高频信息。

1. 岗前培训文字内容：原理、使用方法、用途，安全注意事项等

培训内容：

实验室安全：

1、实验室门禁卡仅限本人使用，妥善保管，不得借给他人，也不得借他人校园卡，并且严禁进行手机复制卡片，不得带他人进入实验室；

2、实验室所放所有试剂需进行台账登记，并及时更新；

3、进入实验室必须穿白大褂，戴口罩，实验室内不允许吃东西。

4、实验室内所有仪器，必须经过预约培训后方可使用。

5、实验结束后要整理实验台面，清理实验垃圾，关闭实验所用仪器并登记实验室出入登记本、实验室安全日志、以及仪器使用登记本；

6、实验室垃圾分类处理，并登记相应的台账；

7、离开实验室需检查水、电、门、窗及空调是否关闭，最后锁门离开。

技术注意事项：

【使用前注意】

（一）环境要求

1、温度需保持在 22℃左右，湿度控制在 65% 以下，换季时尤其要注意温湿度变化对仪器的影响。

2、确保仪器放置环境清洁，无灰尘、无腐蚀性气体，避免阳光直射。

（二）样本准备

1、根据样本类型选择合适的载具，如玻片、培养皿（35/60mm）、孔板、腔室等，且载具厚度推荐为 170μm。常见样本类型包括动物的器官组织切片、细胞爬片、悬浮细胞、胚胎、类器官，植物的根茎、叶片、花粉，小型模式生物（线虫、斑马鱼、果蝇等昆虫）以及微生物（细菌、真菌等）。

2、样本制备需严格按照标准流程进行。例如，石蜡切片要经过取材固定、脱水、透明、浸蜡包埋、脱蜡水化、染色封片等步骤；冰冻切片则需取材固定、蔗糖脱水、OCT 包埋、切片、染色封片。在染色过程中，要注意选择合适的荧光染料和探针，如标记细胞核可选用 Hochest 33342、DAPI 等，标记线粒体可选用 MitoTracker AIF 等。同时，整个免疫荧光染色过程中，要注意避免样品干涸，防止样品形态改变和背景荧光增加。

3、封片剂可用缓冲甘油或防淬灭剂等，对于活细胞，则可使其浸润于相应的溶液中，直接滴片和封片，立即观察，不加上述封片剂。封片推荐液体封片剂，并在玻片周围用无荧光透明指甲油封层。不推荐使用固体封片剂。

4、设计实验时要设置好对照，多色标记需有单标，所有实验开始前尽量进行预实验，摸索抗体浓度、固定时间等关键步骤，且平行实验条件要完全一致。

5、实验设计前请了解仪器相关配置参数，选择合适的抗体或荧光染料等。蔡司LSM900共聚焦显微镜激光器波长分别为405nm（紫外）、488nm（绿光）、561nm（红光）、640nm（深红）。同时为了避免使用冲突，请提前预约使用时间。

6、为了获得理想的图像，组织切片或细胞标本不能太厚及太密，并且应避免细胞重叠或杂质掩盖。

7、为保持组织细胞的完整性和所要检测物质的抗原性，非活细胞观察的样品请尽量用固定剂固定样品。

8、用前请用荧光显微镜确认一下是否有荧光，条件摸索调整合适后再使用共聚焦显微镜。

（三）仪器检查

1、检查稳压电源，打开稳压电源背后总开关和前面开关，确认显示 220V。

2、检查 UPS 状态，确保其正常工作，防止突然断电对仪器造成损害。

【使用时注意】

严格按照使用规程操作，不得任意改变操作程序，激光共聚焦显微镜系统中的激光器使用寿命有限且价格昂贵。所以，在操作过程中切记，在开关的启动顺序以及在扫描过程中努力做到快速有序，保护好激光器。

（一）开机流程（关机流程相反）

1、开启总电源后，将 ①Laser Module “LM” 的钥匙从 “0” 转到 “1”。

2、依次打开 ②“System” 和 ③“Components”。

3、打开电动显微镜电源 ④“Power Supply 232” 和⑤电动载物台电源。

4、打开金属卤化物灯 ⑥“HXP 120”，注意 30 分钟之内不要反复开关。

5、最后启动 ZEN 软件（Blue），选择 “ZEN system”。

（二）镜头使用

1、根据实验需求选择合适的物镜，如 10x/0.45 空气镜、20x/0.8 空气镜、40x/0.95 空气镜、63x/1.4 油镜等。不同物镜的分辨率不同，数值孔径（NA）也不同，可根据样本观察需求进行选择。

2、使用完 63 倍油镜后，务必用无水乙醇按照一个方向擦拭物镜，再转换到 40x/20x/10x 等物镜，防止油污染其他镜头。

（三）波长设置

1、根据所使用的荧光基团选择匹配的激光波长，如 405nm（适用于 DAPI、Hoechst 等）、488nm（适用于 GFP、Alexa Fluor 488、FITC 等）、561nm（适用于 RFP、Alexa Fluor 568、Cy3 等）、640nm（适用于 Alexa Fluor 647、Cy5 等）。

2、在进行多通道成像时，要考虑不同荧光染料发射波长的差异，选择合适的拍摄方式（Fastest、Best signal、Smartest (Line)），以平衡拍摄速度和串色问题。例如，Fastest 拍摄速度快，但发射波长接近的荧光染料间存在串色现象，适用于活细胞成像或不同通道发射峰相距较远的情况；Best signal 拍摄速度最慢，基本避免串色，适合固定样本成像；Smartest (Line) 结合两者优势，在减少串色的同时拍摄速度较快，但光路中硬件设置不能改变 。

（四）成像参数设置

1、图像亮度相关参数：激光强度（Laser）、针孔大小（Pinhole）、检测器增益（Master Gain）等参数会影响图像亮度。Laser 功率越高，信号越亮，但光毒性越大；Pinhole 默认标准值为 1AU，增大 Pinhole 可提高图像亮度，但会增加非焦面信息，使图像不锐利，减少 Pinhole 可增加景深，但会降低图像亮度；Master Gain 一般在 600 - 850V 之间，越高信号越亮，但噪音也会越大。可通过 Live 下的 Range indicator 观察曝光程度，避免图像过曝或过暗。

2、信噪比相关参数：扫描速度（Speed）和平均次数（Averaging）影响图像信噪比。扫描速度越慢，信噪比越好，但光漂白越多；增加 Averaging 次数可减少噪音，但会增加扫描时间。建议扫描速度和平均次数的参数分别设置为 5 - 8 和 2 或 4 。

3、分辨率相关参数：一般图像使用 512x512 像素能满足 300dpi 要求，追求更高分辨率可点击 confocal 调用最佳采样率。同时，Airyscan 模式下可提升分辨率，其分辨率可提升 1.7 倍，信噪比提升 4 - 8 倍。

（五）成像模式操作

1、多通道成像：在 “Locate” 界面选择快捷键，将样品区域置于视野中央，进入 “Acquisition” 界面，选择之前保存的光路设置或新建光路设置（“Smart Setup”），设置好染料名称、拍摄方式、激光强度、针孔大小、检测器增益等参数后，选择需要成像的 track，单击 “Snap” 获取图像。

2、Z - stack 成像：有 “First/Last” 和 “Center” 两种模式。“First/Last” 模式下，在预览状态设置起始和结束位置，单击 “Optimal” 设置最佳间隔；“Center” 模式下，在 live 下选择成像中间位置，单击 “center”，设置层数并单击 “optimal”。多通道荧光拍摄 Z - stack 时，可通过点击 “Match Pinhole” 自动调节不同 track 的针孔使光切厚度相似，或手动调节针孔保证荧光强度和光切厚度一致。

3、时间序列成像：选择 “Time Series”，设置拍摄持续时间（如循环数 cycles 或具体时间）、循环间隔 Interval，结合自动对焦（如 Software Autofocus 的 Intensity 模式等）进行长时间成像，以避免 z 轴漂移。

4、Tile Scan 成像：“Tiles” 方法是以现在视野为中心拍摄拼图，设置 “X”“Y” 方向拼图范围并添加到拼图区域；“Stake” 方法通过定义拼图边缘自动计算拼图大小。建立好拼图范围后，在 “Focus Surface and Support Points” 中选择支持点，确定焦距变化，可通过手动校正、软件自动对焦（AF）或 Definite Focus（DF）自动对焦系统进行焦距校正。

5、Airyscan 成像：点击 “Smart Setup” 选择染料，点击 “Airyscan” 选择模式（如 SR 模式、快速模式），选择 “Best Signal” 或 “Smartest” 模式，设置激光大小、检测器增益等参数，扫描区域居中，选择最快扫描速度，“Crop Area” 不小于 1.3，双向扫描，“Averaging” 选择 “None”。拍摄完成后按照 “Processing→Airyscan Processing→Input→Apply” 进行图像处理，2D 图像可勾选 “2D SR Processing” 提高分辨率，3D 图像选择 “3D Processing”。

四、使用后注意事项

1、样本处理：妥善处理使用过的样本，避免污染环境。如果样本具有生物危害性，需按照相关规定进行无害化处理。

2、仪器关机：按照与开机相反的顺序关闭仪器各部件电源。先关闭 ZEN 软件，再关闭金属卤化物灯、电动显微镜电源、电动载物台电源，将 Laser Module “LM” 的钥匙转回 “0”，最后关闭稳压电源前面开关和背后总开关。

3、数据保存：将拍摄的数据及时保存到 D 盘，不可保存到 C 盘。如需拷贝数据，可使用光盘或格式化后的 U 盘进行拷贝。

仪器清洁：使用吸耳球吹去仪器表面灰尘，用干净的软布擦拭仪器外壳。若镜头有污染，按照正确方法进行清洁，确保仪器处于良好的备用状态。